撰文：EP

編輯：circRNA

排版：Siuyee

研究背景

RNA療法已經發展成為一種強大的治療策略，然而其較短的半衰期限制了效用。RNA環化可抵抗核酸外切酶介導的降解，被認為是一種減緩RNA降解的有前景的方法。環狀RNA（cRNA）的生產通常涉及RNaseR富集和高效液相色譜（HPLC）純化，以減少體外轉錄（IVT）過程中產生的雙鏈RNA引發的免疫反應，因此產量較低（通常低于輸入RNA的1%）。cRNA的高效生產和純化方法，一定程度上限制了其更廣泛的應用。

通過cRNA實現的用途涉及與免疫系統的相互作用。已有不少cRNA表達抗原誘導免疫應答用于疫苗開發的研究。然而，基于cRNA靶向基因組和表觀基因組的療法中，免疫反應可能會抑制治療效果。因此，去免疫是一個更難解決的問題，尤其是在cRNA遞送非人源蛋白的情況下。

近日，美國加州大學Prashant Mali研究團隊在Nat Biomed Eng雜志上發表研究論文：Robust genome and cell engineering via in vitro and in situ circularized RNAs。論文闡述了研究團隊開發的兩種RNA環化方法:利用II組內含子體外制備cRNA (ocRNA)，以及使用內源性普遍表達的RtcB蛋白在細胞內環化生成cRNA (icRNA)。研究還證實了cRNA可應用于干細胞工程以及通過鋅指(ZF)蛋白和CRISPR-Cas9系統實現強大的靶向基因組和表觀基因組作用。

一、 制備ocRNA和icRNA

研究采用來自破傷風梭菌的II型內含子，并添加側翼扭轉核酶改善遠程相互作用，體外制備ocRNA。通過Sanger測序檢測外顯子結合位點（EBS）之間的26nt剪接痕，證實了RNA環化。進一步分析環化產物實現環化效率在70%左右，純化后產率60%。（圖1）

此外，研究通過加入在目的序列上IRES和有效負載的兩側使用扭轉核酶，轉錄出線性RNA，遞送進細胞后，在普遍存在的細胞內源性RNA連接酶RtcB作用下，線性RNA連接5 '和3 '端，實現原位環化。icRNA環化水平~20%，隨時間推移比例增加，且cRNA表達的GFP比線性原位環狀化缺陷RNA (icdRNAs)的持久。（圖1）

圖1 制備ocRNA和icRNA

二、工程改進cRNA的翻譯

研究篩選了19個天然存在和合成的IRES序列，發現腦心肌炎病毒IRES（EMCV）和柯薩奇病毒B3 IRES介導cRNA翻譯效果最好，因此加入EMCV IRES元件及有助改善翻譯的3’UTR和poly(A) stretch重新設計cRNA，以提高cRNA的翻譯效率。（圖2）

三、開發簡易的cRNA純化方案

為尋求使用更簡單和更經濟的純化方法，在icRNA IVT過程中加入尿素作為變性劑，減少通過T7聚合酶轉錄所固有的高度免疫原性和dsRNA產生；對于ocRNA，因為在添加變性劑后，剪接的關鍵二級結構被取消，因此，依賴纖維素色譜法選擇性去除長度超過30 bp的dsRNA(長于cRNAs中關鍵的IRES二級結構)。純化后的icRNA和ocRNA表現出輕微的免疫反應，ocRNA誘導的免疫翻譯幾乎無法檢測到。雖然HPLC純化是臨床翻譯的首選方法，但上述cRNA純化方法為大多數體外和體內應用提供了可行的替代方法。（圖2）

圖2 ocRNA和icRNA的優化與表征。

四、cRNA的功能表征

利用干細胞來源的神經元細胞和心肌細胞驗證cRNA的表達，結果發現與編碼GFP的線性RNA相比，cRNA表達明顯更持久。進一步結果表明，潛在細胞內容物的表達取決于IRES活性和/或對非分裂細胞的偏好，與分裂細胞相比，非分裂細胞在轉染后不會迅速稀釋RNA水平。H1人類多能干細胞(hPSCs)中單次轉染NEUROD1 cRNA，可在1周內分化為神經元，這證明了干細胞向非分裂細胞的分化，可以更好地利用持久icRNA提供的高表達的蛋白質積累。（圖2-3）

研究進一步制備icRNA或icdRNA的脂質納米顆粒(LNPs)，眼球后靜脈注射到小鼠體內，結果表明icRNA可在體內原位環化，cRNA在小鼠體內至少可持續表達7天，而線性mRNA在第7天后大部分降解。

圖3 評估ocRNA和icRNA的持久性和活性。

五、cRNA遞送ZF蛋白實現基因組和表觀基因組工程

除了持續轉基因表達的應用之外，cRNA還可能促進有效靶向基因組，特別是表觀基因組的應用。ZF蛋白作為一種完全基于蛋白質的基因組工程，特別適合cRNA這種持續的傳遞模式。研究證明，鋅指核酸酶(ZFN) icRNAs確實可以進行更有效的基因組編輯。（圖4）

PCSK9的功能缺失突變與心血管疾病風險降低相關。研究在HeLa細胞中篩選出16個靶向hPCSK9轉錄起始位點，有效抑制基因表達的ZF-KRAB蛋白模塊；利用cRNA融合表達3A3L DNA甲基轉移酶和ZF-KRAB蛋白模塊，在12天內有效抑制了PCSK9的表達；利用cRNA遞送ZF瞬時表達表觀基因組調控子，可以實現強效的基因抑制，從而實現無基因組疤痕且安全的方法調節治療性基因表達。（圖4）

圖4 icRNA和ocRNA在ZF介導的基因組和表觀基因組靶向中的應用

六、通過cRNAs遞送去免疫CRISPR-Cas實現基因組和表觀基因組工程

因為CRISPR系統來自原核生物，cRNA的持久性表達特征可能會加劇CRISPR系統在治療環境中的免疫反應。因此，在維持cRNA持久性表達的情況下，有必要通過組合突變，尤其是突變具有免疫原性的表位，篩選去免疫Cas9蛋白。研究開發了一種能篩選百萬個基因的LORAX蛋白工程方法，在自然環境中檢測核苷酸多態性(SNPs)，篩選突變文庫。研究最終結合netMHC表位預測軟件對免疫原性的評估，確定導致免疫原性表位去免疫的最有效候選突變。（圖5）

然后，利用長讀Nanopore測序檢測組合突變文庫的篩選結果，Nanopore測序很好地規避了短讀測序的限制，對整個目標基因進行單分子測序，使文庫設計策略能夠覆蓋分子的全長區域。最后，研究經過一系列的篩選和驗證得到功能正常的去免疫Cas9。（圖5）

圖5  LORAX蛋白工程方法篩選去免疫Cas9變異體。

研究將WT SpCas9或突變體SpCas9v4的icRNA，以及靶向AAVS1的sgRNA轉染到HEK293Ts中，成功編輯AAVS1基因組；將WT型dSpCas9或突變型dSpCas9v4 CRISPRoff的icRNA和ocRNA以及靶向B2M基因的sgRNA轉染到HEK293Ts中，證實了對B2M基因的抑制作用。通過測試分析發現，體外環化的ocRNA對SpCas9和CRISPRoff插入序列的環化效率分別約為40%和20%。研究通過RNA-seq證實了SpCas9v4和SpCas9在該實驗中具有相當的特異性。（圖6）

圖6 LORAX篩選驗證鑒定出Cas9去免疫變異體，以及通過icRNA和ocRNA遞送靶向基因組和表觀基因組作用。

總結

研究開發了利用II型內含子體外環化cRNAs，還通過內源表達的RtcB蛋白進行細胞內原位環化產生cRNA。此外，研究開發了無高效液相色譜純化方案，使cRNA高產量，且保持低免疫反應。由此產生的cRNA簡單和可擴展地促進了干細胞工程，以及通過ZF蛋白和CRISPR-Cas9系統進行強大的靶向基因組和表觀基因組的一系列應用。特別是，攜帶EMCV IRES的icRNA和ocRNA在心肌細胞和神經元中表現出強大的表達(與線性加帽和修飾的RNA相比)，并且延長了RNA的持久性，強調了cRNA在非分裂細胞中的巨大前景和效用。此外，研究團隊的環化策略允許高效地生成和遞送大分子蛋白，如Cas9和CRISPRoff，有效解決慢病毒和腺相關病毒包裝限制的問題。

原文鏈接

https://www.nature.com/articles/s41551-024-01245-z