Nanopore Direct RNA測序

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Nanopore直接RNA測序技術(shù)是對天然RNA進(jìn)行測序，是對單個RNA分子進(jìn)行單分子水平的全長測序，能夠保留并檢測RNA堿基修飾信息，對poly(A)尾長進(jìn)行相對準(zhǔn)確的估算，同時進(jìn)行全長異構(gòu)體分析，還原真實(shí)RNA特征。

Nanopore Direct RNA測序流程圖（2019 Workman et al）

測序方案

測序模式：Nanopore Sequencing
測序數(shù)據(jù)量：6Gb/樣，or 10Gb/樣，or 15Gb/樣

技術(shù)優(yōu)勢

1、Direct RNA技術(shù)無需PCR，無GC偏好性提供無偏全長且鏈特異的RNA序列；
2、Direct RNA技術(shù)準(zhǔn)確檢測poly(A)尾長度為分析RNA穩(wěn)定性和翻譯效率等轉(zhuǎn)錄后調(diào)控研究提供幫助；
3、Direct RNA技術(shù)直接識別RNA堿基修飾信號實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄和表觀信息的一舉多得。
利用Nanopore測序技術(shù)對人類poly(A)轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行直接RNA測序
高通量cDNA測序使我們對轉(zhuǎn)錄組的復(fù)雜性和調(diào)控有了更深入的了解，但是該方法不能完全展現(xiàn)轉(zhuǎn)錄組的真實(shí)信息，其測序讀長較短并且去除了天然RNA的堿基修飾信息。本研究利用Nanopore直接RNA測序技術(shù)從人類B淋巴細(xì)胞系GM12878分離并測序了原始poly(A) RNA，共生成約990萬條通過質(zhì)控的poly(A) RNA序列，讀長N50約1,334bp。利用以上長讀長數(shù)據(jù)，研究者首先檢測和分析了轉(zhuǎn)錄異構(gòu)體，在代表10,793個基因的33,984個異構(gòu)體中，發(fā)現(xiàn)52.6%未經(jīng)注釋的剪接連接點(diǎn)，識別出了上千個目前在GENCODE v27中未經(jīng)注釋的基因，并發(fā)現(xiàn)了使用短讀長測序則無法檢測到的等位基因特異性異構(gòu)體。例如：IFIH1基因，其父系同型保留了8號外顯子，而母系同型則不保留8號外顯子（圖1）。

圖1 ONT直接RNA測序轉(zhuǎn)錄本識別FIH1的等位基因特異性異構(gòu)體的IGV視圖。紫色方框指示等位基因特異性的SNP的位置（灰色為參考，紅色和藍(lán)色為SNPs），綠色方框指示可變剪接外顯子。

隨后結(jié)合短讀長數(shù)據(jù)，研究團(tuán)隊直接測量了poly(A)尾長，分析發(fā)現(xiàn)了異構(gòu)體間poly(A)尾的區(qū)別。采用ONT直接RNA測序?qū)NA結(jié)合蛋白DEAD-box解旋酶5（DDX5）的轉(zhuǎn)錄本poly(A)尾長度進(jìn)行估計，內(nèi)含子保留異構(gòu)體的poly(A)尾長中值為327nt，而其蛋白編碼異構(gòu)體的poly(A)尾長中值為125nt（圖2）。

圖2 DDX5基因兩種轉(zhuǎn)錄本異構(gòu)體的poly(A)尾長分布及基因模型

最后，利用直接RNA測序數(shù)據(jù)中包含的RNA修飾信息，研究人員篩選了GENCODE敏感亞型的離子電流在GGACU模體(motif)上的改變，發(fā)現(xiàn)了86個基因(198個異構(gòu)體) 的電流變化可以歸因于異構(gòu)體特異性m6A修飾。

圖3 SNHG8基因異構(gòu)體內(nèi)GGACU motif的離子電流分布

研究人員表示基于短讀長測序的RNA修飾分析去除了修飾之間以及修飾與其他RNA之間的特征，而Nanopore直接RNA測序則具備檢測這些遠(yuǎn)程互作的能力。

參考文獻(xiàn)
Workman R E, Tang A D, Tang P S, et al. Nanopore native RNA sequencing of a human poly (A) transcriptome[J]. Nature methods, 2019: 1-9.
生信分析

isoform分析
可變剪切分析
融合基因鑒定
PolyA分析

表達(dá)定量
轉(zhuǎn)錄本定量
轉(zhuǎn)錄本差異分析
富集分析
蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)

甲基化修飾分析
m⁶A位點(diǎn)注釋
甲基化修飾富集分析
m⁶A差異分析

isoform聯(lián)合定量表達(dá)分析
AltTP分析
功能多樣性分析（FDA）
差異富集分析

新生mRNA分析
識別新生mRNA
新生mRNA半衰期分析
mRNA穩(wěn)定相關(guān)性分析
新生mRNA差異分析

Table. Nanopore Direct RNA Sequencing樣本送樣建議

送樣類型	送樣量	完整性（RIN值）	濃度	純度
Total RNA（組織、細(xì)胞、全血等）	≥50μg	≥8	≥180ng/μL	無DNA，蛋白/鹽離子等污染，樣本無色透明不粘稠
RNA帶poly(A)尾	≥300ng	-	≥50ng/μL	無DNA，蛋白/鹽離子等污染，樣本無色透明不粘稠