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  • Nanopore Direct RNA測序

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    Nanopore直接RNA測序技術(shù)是對天然RNA進(jìn)行測序,是對單個RNA分子進(jìn)行單分子水平的全長測序,能夠保留并檢測RNA堿基修飾信息,對poly(A)尾長進(jìn)行相對準(zhǔn)確的估算,同時進(jìn)行全長異構(gòu)體分析,還原真實(shí)RNA特征。



    Nanopore Direct RNA測序流程圖(2019 Workman et al



    測序方案


    測序模式:Nanopore Sequencing

    測序數(shù)據(jù)量:6Gb/樣,or 10Gb/樣,or 15Gb/樣



    技術(shù)優(yōu)勢


    1、Direct RNA技術(shù)無需PCR,無GC偏好性提供無偏全長且鏈特異的RNA序列;

    2、Direct RNA技術(shù)準(zhǔn)確檢測poly(A)尾長度為分析RNA穩(wěn)定性和翻譯效率等轉(zhuǎn)錄后調(diào)控研究提供幫助;

    3、Direct RNA技術(shù)直接識別RNA堿基修飾信號實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄和表觀信息的一舉多得。



  • 利用Nanopore測序技術(shù)對人類poly(A)轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行直接RNA測序

    高通量cDNA測序使我們對轉(zhuǎn)錄組的復(fù)雜性和調(diào)控有了更深入的了解,但是該方法不能完全展現(xiàn)轉(zhuǎn)錄組的真實(shí)信息,其測序讀長較短并且去除了天然RNA的堿基修飾信息。本研究利用Nanopore直接RNA測序技術(shù)從人類B淋巴細(xì)胞系GM12878分離并測序了原始poly(A) RNA,共生成約990萬條通過質(zhì)控的poly(A) RNA序列,讀長N50約1,334bp。利用以上長讀長數(shù)據(jù),研究者首先檢測和分析了轉(zhuǎn)錄異構(gòu)體,在代表10,793個基因的33,984個異構(gòu)體中,發(fā)現(xiàn)52.6%未經(jīng)注釋的剪接連接點(diǎn),識別出了上千個目前在GENCODE v27中未經(jīng)注釋的基因,并發(fā)現(xiàn)了使用短讀長測序則無法檢測到的等位基因特異性異構(gòu)體。例如:IFIH1基因,其父系同型保留了8號外顯子,而母系同型則不保留8號外顯子(圖1)。


     1 ONT直接RNA測序轉(zhuǎn)錄本識別FIH1的等位基因特異性異構(gòu)體的IGV視圖。紫色方框指示等位基因特異性的SNP的位置(灰色為參考,紅色和藍(lán)色為SNPs),綠色方框指示可變剪接外顯子。



    隨后結(jié)合短讀長數(shù)據(jù),研究團(tuán)隊直接測量了poly(A)尾長,分析發(fā)現(xiàn)了異構(gòu)體間poly(A)尾的區(qū)別。采用ONT直接RNA測序?qū)NA結(jié)合蛋白DEAD-box解旋酶5(DDX5)的轉(zhuǎn)錄本poly(A)尾長度進(jìn)行估計,內(nèi)含子保留異構(gòu)體的poly(A)尾長中值為327nt,而其蛋白編碼異構(gòu)體的poly(A)尾長中值為125nt(圖2)。



    2 DDX5基因兩種轉(zhuǎn)錄本異構(gòu)體的poly(A)尾長分布及基因模型



    最后,利用直接RNA測序數(shù)據(jù)中包含的RNA修飾信息,研究人員篩選了GENCODE敏感亞型的離子電流在GGACU模體(motif)上的改變,發(fā)現(xiàn)了86個基因(198個異構(gòu)體) 的電流變化可以歸因于異構(gòu)體特異性m6A修飾。


    3 SNHG8基因異構(gòu)體內(nèi)GGACU motif的離子電流分布


    研究人員表示基于短讀長測序的RNA修飾分析去除了修飾之間以及修飾與其他RNA之間的特征,而Nanopore直接RNA測序則具備檢測這些遠(yuǎn)程互作的能力。



    參考文獻(xiàn)

    Workman R E, Tang A D, Tang P S, et al. Nanopore native RNA sequencing of a human poly (A) transcriptome[J]. Nature methods, 2019: 1-9.





  • 生信分析


    isoform分析

    可變剪切分析

    融合基因鑒定

    PolyA分析

     

    表達(dá)定量

    轉(zhuǎn)錄本定量

    轉(zhuǎn)錄本差異分析

    富集分析

    蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)

     

    甲基化修飾分析

    m6A位點(diǎn)注釋

    甲基化修飾富集分析

    m6A差異分析

     

    isoform聯(lián)合定量表達(dá)分析

    AltTP分析

    功能多樣性分析(FDA)

    差異富集分析

     

    新生mRNA分析

    識別新生mRNA

    新生mRNA半衰期分析

    mRNA穩(wěn)定相關(guān)性分析

    新生mRNA差異分析




  • Table. Nanopore Direct RNA Sequencing樣本送樣建議

    送樣類型

    送樣量

    完整性(RIN值)

    濃度

    純度

    Total RNA(組織、細(xì)胞、全血等)

    ≥50μg

    ≥8

    ≥180ng/μL

    DNA,蛋白/鹽離子等污染,樣本無色透明不粘稠

    RNA帶poly(A)尾

    ≥300ng

    -

    ≥50ng/μL

    DNA,蛋白/鹽離子等污染,樣本無色透明不粘稠


    *更具體的送樣方法請詳詢銷售或技術(shù)支持


    物種范圍

    人、小鼠、大鼠等哺乳動物,植物等其他物種詳詢銷售或技術(shù)支持




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