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  • DRUG-seq

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    DRUG-seq,全稱Digital RNA with pertUrbation of Genes (DRUG)-seq,即高通量藥物篩選RNA測序。該技術對在96/384孔板上的微量細胞,通過孔標簽及UMI定量技術進行全長擴增的轉(zhuǎn)錄組測序技術,是CMC申報流程中前期藥物篩選的重要環(huán)節(jié)。在進行數(shù)百種候選藥物和實驗條件的高通量篩選時,實現(xiàn)全部樣本的轉(zhuǎn)錄組同時檢測,獲取豐富的藥物作用信息。Drug-seq可以利用精準分析表達譜,從而定位藥物影響細胞的特異代謝途徑,同步揭示用藥后細胞轉(zhuǎn)錄水平的變化,全面、深入地評估候選藥物,提升藥物發(fā)現(xiàn)的效率和成功率。


    DRUG-seq技術路線圖



    DRUG-seq應用


    1. 確定化合物作用機理:驗證已知靶點化合物作用機理,或推測未知靶點化合物的可能的作用機理;

    2. 研究不同化合物對間接靶點的劑量動力學差異;

    3. 評估不同化合物引起的生物功能差異;

    4. 評價化合物作用于非靶基因引起的生物功能等。



    測序方案


    測序模式:Illumina Novaseq

    測序數(shù)據(jù)量:1-2G/well



    Drug-seq技術優(yōu)勢


    1.通量高:可一次性獲得96或384孔板所有孔細胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄組水平的基因表達情況;


    2.周期短:同時進行96孔或384孔樣本的實驗,實驗周期短至20個工作日;


    3.成本低:96孔或384孔樣本合并建庫測序,成本遠低于傳統(tǒng)RNA-seq;


    4.起始量少:細胞起始量在2,000~20,000均可實驗;


    5.分辨率更高:相比傳統(tǒng)藥物高通量篩選技術針對于細胞表型,基于RNA測序Drug-seq藥物篩選技術可以針對基因?qū)用妫?/span>


    6.生信分析全面:可做標準化分析,也可根據(jù)要求定制分析;基于基因差異表達的分析,既可定位至藥物影響下細胞的特異代謝途徑,又可以同步揭示藥物的其他作用效應,獲取多維的藥物作用信息,全面評估藥物的作用機制。




  • 研究對8個劑量的433種化合物進行概念驗證實驗中,由DRUG-seq技術獲得的轉(zhuǎn)錄譜成功地根據(jù)其預期靶點的作用機制(MoAs)將化合物進行功能分類。在涉及相同靶標的化合物中檢測到反映在轉(zhuǎn)錄組變化中的擾動差異,證明了使用DRUG-seq了解靶標上和脫靶活性的價值。[1]




    1. DRUG-seq的性能與標準RNA-seq相當





    2. 化合物與調(diào)控機制的tSNE聚類分析






    3. 不同濃度化合物處理后,具體基因的表達變化





    4. 化合物處理后,差異基因表達分析



    參考文獻

    [1] Ye C, Ho DJ, Neri M, et al. DRUG-seq for miniaturized high-throughput transcriptome profiling in drug discovery. Nat Commun. 2018, 9(1):4307. doi: 10.1038/s41467-018-06500-x.


  • 生物信息分析


    基礎分析

    1. 原始數(shù)據(jù)質(zhì)控檢查

    2. 比對結(jié)果質(zhì)控檢查

    3. 基因表達定量分析

    4. 樣品主成分分析

    5. 樣品與基因聚類分析

    6. 差異基因表達分析

    7. 差異基因GO功能分析

    8. 差異基因KEGG通路分析

    9. 差異基因Rectome通路分析

    10. 差異基因GSEA富集分析

     

    個性化分析

    1. 相關基因互作分析(藥物處理后,與疾病相關的所有基因及其相互作用關系)

    2. 基因共表達分析(藥物處理后,與疾病相關的所有基因及其相互作用關系)

    3. 趨勢分析(不同藥物濃度處理的基因表達變化,藥物處理后不同時間段的變化——時序分析)

    (其他定制化分析請詳詢)





  • Table. Drug-seq樣本送樣建議


    送樣類型

    送樣量

    操作參考

    寄送方法

    貼壁細胞

    2000-10000 cells

    50-100μL PBS 洗滌細胞兩遍, 徹底去除PBS,加30uL Lysis Mix,室溫吹打裂解 6 min

    液氮速凍,-80℃保存,干冰寄送,裂解物不要凍融,處理后當天寄出

    懸浮細胞

    2000-10000 cells

    細胞培養(yǎng)懸液吹打混勻,每孔取出10uL,按照1:1加入Lysis Mix(10μL),混勻室溫裂解 6 min

    液氮速凍,-80℃保存,干冰寄送,裂解物不要凍融,處理后當天寄出


    *更具體的送樣方法請詳詢銷售或技術支持


  • 1.該產(chǎn)品可同時完成96例樣本的混合建庫,如何獲得對應樣本的序列信息?

    答:通過特定的樣本標簽well barcode以及UMI定量技術,在96孔板中進行不同樣本的mRNA標記,標記完成的cDNA可以混合在一起,構(gòu)建1個混樣的NGS文庫。NGS測序后通過barcode序列識別空標簽,并將well barcode和UMI信息拆分還原到96孔板的不同樣本。在取用樣本標簽時,應注意標記每孔所對應的UMI各孔編號,否則導致該孔對應轉(zhuǎn)錄組文庫信息無法正確拆分。

     

    2.每孔樣本標簽UMI可以反復使用嗎?

    答:每孔對應的樣本標簽well barcode和UMI只能使用一次,避免反復使用出現(xiàn)交叉污染。使用樣本標簽時,冰上融化后震蕩混勻離心后用槍頭扎破使用,切勿撕掉膜使用。

     

    3.試劑盒適用于什么其實材料?

    答:新鮮細胞和凍存細胞(推薦細胞投入量:5k~30k/well),Total RNA(推薦投入量20ng~100ng/well)

     

    4.細胞裂解和RNA捕獲時,裂解的時間對獲得cDNA的影響?

    答:為了獲得質(zhì)控較好的cDNA,按照實驗要求時間操作,裂解時間過長時,RNA容易降解,后續(xù)cDNA中小片段占比高。

     

    5.混合建庫測序時,是否有推薦的測序量?

    答:推薦測序數(shù)據(jù)量:1G/well

     


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