服務(wù)介紹

慢病毒可以將外源基因有效地整合到宿主染色體上，從而達(dá)到持久性表達(dá)，可有效地感染神經(jīng)元細(xì)胞、肝細(xì)胞、心肌細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、干細(xì)胞等多種類型的細(xì)胞，從而達(dá)到良好的基因治療效果，具有廣闊的應(yīng)用前景。

吉賽生物針對(duì)各種RNA提供慢病毒包裝服務(wù)，包括circRNA、mRNA和lncRNA。

技術(shù)優(yōu)勢(shì)

1. 用于常規(guī)細(xì)胞感染，強(qiáng)大的基因傳遞工具；

2. 永久整合到基因組中，便于穩(wěn)轉(zhuǎn)株的構(gòu)建，持續(xù)傳代；

3. 可用于轉(zhuǎn)基因動(dòng)物和動(dòng)物模型的構(gòu)建；

4. 基因治療：通過造血干細(xì)胞治療遺傳性疾病。例如白血病，地中海貧血等；

5. 細(xì)胞治療：CAR-T治療癌癥。

客戶提供

由我司構(gòu)建載體：載體構(gòu)建的合同編號(hào)和基因名稱（ID）。

由客戶提供載體：載體序列文件，或酶切位點(diǎn)位置以及5’LTR-3’LTR之間的序列長(zhǎng)度；濃度>500ng/ul、質(zhì)粒量>10ug的質(zhì)粒

我們提供

1. 目的基因慢病毒和對(duì)照慢病毒；

2. 慢病毒滴度檢測(cè)報(bào)告。

慢病毒載體的研究發(fā)展得很快，研究的也非常深入。該載體可以將外源基因有效地整合到宿主染色體上，從而達(dá)到持久性表達(dá)。在感染能力方面可有效地感染神經(jīng)元細(xì)胞、肝細(xì)胞、心肌細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、干細(xì)胞等多種類型的細(xì)胞，從而達(dá)到良好的的基因治療效果，因此具有廣闊的應(yīng)用前景。

案例1：

本文研究中，作者通過環(huán)狀RNAs測(cè)序，在人類ICC組織中鑒定出circNFIB (hsa_circ_0086376，以下簡(jiǎn)稱cNFIB)。并進(jìn)行了一系列的體外和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，探討cNFIB對(duì)MEK抑制劑曲美替尼抗腫瘤活性的影響。

研究結(jié)果表明，與曲美替尼和編碼cNFIB的慢病毒載體共治療比單獨(dú)的曲美替尼治療表現(xiàn)出更大的抑制作用。[1]

案例2：

Neuro-oncology雜志（IF=10.247）在線發(fā)表了中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院張弩教授最新的研究成果，報(bào)道發(fā)現(xiàn)EGFR來源的circRNA可以特殊的滾環(huán)翻譯和程序化-1核糖體移碼（-1PRF）誘導(dǎo)的框外終止密碼子（OSC），形成一系列的滾動(dòng)翻譯EGFR（rtEGFR）。rtEGFR可以結(jié)合并穩(wěn)定EGFR，在成人膠質(zhì)母細(xì)胞瘤（GBM）成瘤和Nimotuzumab藥敏相關(guān)。

在本文研究中，研究者使用慢病毒轉(zhuǎn)染的穩(wěn)定細(xì)胞系用于評(píng)估rtEGF蛋白在體外和體內(nèi)的生物學(xué)功能。研究結(jié)果顯示circEGFR在GBM標(biāo)本中高表達(dá)，circEGFR翻譯生成的rtEGFR具有促進(jìn)BTIC細(xì)胞成瘤的能力，干擾circEGFR后抑制成瘤速度。[2]

參考文獻(xiàn)：

[1] Jinpeng Du,Tian Lan,Haotian Liao , et al.CircNFIB inhibits tumor growth and metastasis through suppressing MEK1/ERK signaling in intrahepatic cholangiocarcinoma Mol Cancer.(2022).10.1186/s12943-021-01482-9.

[2] Y. Liu, Z. Li, M. Zhang, H. Zhou, X. Wu, J. Zhong, F. Xiao, N. Huang, X. Yang, R. Zeng, L. Yang, Z. Xia, N. Zhang, Rolling-translated EGFR Variants Sustain EGFR Signaling and Promote Glioblastoma Tumorigenicity,Neuro Oncol(2020). 10.1093/neuonc/noaa279.

慢病毒感染293T 細(xì)胞熒光圖

感染48h的細(xì)胞圖

qPCR檢測(cè)病毒滴度

內(nèi)參的標(biāo)準(zhǔn)曲線

病毒基因的標(biāo)曲：

病毒基因的溶解曲線：

病毒滴度結(jié)果：

平均每個(gè)細(xì)胞所含病毒基因數(shù)（M1）=病毒基因拷貝數(shù)/內(nèi)參基因拷貝數(shù)

病毒滴度（TU/ml）=（細(xì)胞數(shù)×稀釋倍數(shù)×M1）/添加病毒體積（mL）×校正系數(shù)×1000

1. 慢病毒包裝的輔助質(zhì)粒是？

二代輔助質(zhì)粒：pMD2.G和psPAX2，三代輔助質(zhì)粒：PLP1、PLP2、PVSV-G

公司目前用的是二代系統(tǒng)。

2. 什么是感染復(fù)數(shù)（MOI）?

感染復(fù)數(shù)(MOI) 指感染細(xì)胞時(shí)一個(gè)細(xì)胞的病毒感染單元。在實(shí)驗(yàn)中某種細(xì)胞感染達(dá)到80%時(shí)的 MOI定義為這種細(xì)胞的最適MOI (實(shí)際使用MOI根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求而定）。

簡(jiǎn)而言之，MOI是指感染指數(shù)，指病毒對(duì)細(xì)胞的感染能力；MOI越高，細(xì)胞越難被感染。

慢病毒感染MOI計(jì)算：

MOI=（病毒滴度×病毒體積）/細(xì)胞數(shù)目。舉例：滴度1x10^8 TU/ml 的慢病毒感染HEK293細(xì)胞所用培養(yǎng)基體積和病毒量；假如24孔板細(xì)胞接種量是5x10^4個(gè)，6孔板細(xì)胞接種為2x10^5個(gè)，T25瓶細(xì)胞接種量5x10^5個(gè)。

在使用慢病毒之前可以通查閱相關(guān)文獻(xiàn)，了解慢病毒對(duì)目的細(xì)胞的親嗜性，感染復(fù)數(shù)(MOI值）以及在體內(nèi)注射所需要的病毒量。如果沒有相關(guān)文獻(xiàn)支持，可以通過感染預(yù)實(shí)驗(yàn)得到合適的感染復(fù)數(shù) ( MOI 值）。

3. Puromycin在慢病毒感染的篩選中的作用機(jī)制？

Puromycin是來源于Streptomyces alboniger的一種氨基核苷類抗生素，中文名為嘌呤霉素，常用于篩選通過質(zhì)粒轉(zhuǎn)染/轉(zhuǎn)化、病毒感染等方法能表達(dá)pac基因(puror)的真核或原核多克隆或單克隆細(xì)胞。Puromycin不僅用于穩(wěn)定細(xì)胞株的篩選，也用于穩(wěn)定細(xì)胞株的維持。

Puromycin的特點(diǎn)是快速作用于細(xì)胞，一般2天內(nèi)可以殺死99%的不表達(dá)pac基因的細(xì)胞。

4. 質(zhì)粒包裝完慢病毒再感染細(xì)胞，整合到目的細(xì)胞染色體上的是整個(gè)質(zhì)粒的線性序列嗎，還是若干個(gè)線性的質(zhì)粒片段？

以pLC5為例，是以過表達(dá)3‘LTR至5’LTR段包裝到慢病毒基因組上，而慢病毒基因組是隨機(jī)整個(gè)整合到宿主基因組上的。出現(xiàn)某些基因如GFP表達(dá)比目的基因表達(dá)高的情況，是因?yàn)楦髯缘膯?dòng)子（CMV\EF1a)整合到宿主基因組上后效率不同所致，而且環(huán)化RNA的環(huán)化也在經(jīng)過慢病毒包裝、整合宿主基因組以及在宿主環(huán)境中目的基因表達(dá)及環(huán)化裝配等層層過程中衰減很多。因此穩(wěn)轉(zhuǎn)株過表達(dá)效率要比過表達(dá)質(zhì)粒的過表達(dá)效率低很多。

5. 用PLC5-ciR質(zhì)粒包的慢病毒，做了細(xì)胞功能性實(shí)驗(yàn)，也就是病毒感染細(xì)胞后流式測(cè)GFP，發(fā)現(xiàn)空載質(zhì)粒的GFP信號(hào)在有些細(xì)胞系中隨時(shí)間變化而下降的厲害，是什么原因？

一般情況下，病毒整合到基因組會(huì)穩(wěn)定表達(dá)GFP。通過GFP的表達(dá)量越來越少可知，這個(gè)基因在瞬時(shí)表達(dá)幾代后傳代丟失了。建議先進(jìn)行穩(wěn)株篩選，除了GFP外還需要一個(gè)篩選基因如puro，藥殺幾代后都帶綠色熒光的話基本就穩(wěn)定整合到基因組了。如果不做篩選，傳幾代后，基因信號(hào)自然會(huì)下降直至消失。