RNA-seq

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全轉錄組測序服務主要針對circRNA、lncRNA和mRNA，一舉三得，一次測序可以同時得到三者分子的表達情況，可應用于新circRNA和lncRNA預測以及已知circRNA和lncRNA表達水平研究等。

全轉錄組測序技術路線

測序方案

測序平臺：Illumina Novaseq 6000/NovaSeq X Plus
測序模式：PE150
測序數據量：10 Gb raw data
競爭性內源RNA網絡揭示了肺癌的復雜分子機制
Crosstalk in competing endogenous RNA network reveals the complex molecular mechanism underlying lung cancer
Oncotarget, 2017, Vol. 8, (No. 53), pp: 91270-91280
IF：5.168
測序策略：全轉錄組測序（包含miRNA測序）
樣本分組：18對肺癌患者外周血及正常人外周血樣本，每3例病癥相似的樣本混合后進行RNA抽提，測序樣本為病人組6例及正常組6例，3對用于miRNA測序，3對用于全轉錄組測序。

作者研究了肺癌發展的轉錄機制。本研究對肺癌病例組及健康對照組血液樣本進行RNA測序分析，識別了一系列差異表達的miRNA、circRNA、mRNA及lncRNA，并進行了通路富集分析?；趍iRNA靶向基因作用，建立起競爭性內源RNA互作網絡，并篩選出重要節點。在肺癌患者中有59個miRNA，18306個基因，232個lncRNA及292個circRNA的表達發生顯著改變（圖1）。這些miRNA與癌癥的通路、結直腸癌及癌癥的轉錄錯誤調控等癌癥相關的通路緊密相關。此外，差異表達的基因顯著富集在嗅覺轉導和神經活性配體受體相互作用這兩條新的通路上（圖2）。在競爭性內源RNA網絡中發現了5個中樞miRNA（圖3），其中在hsa-miR-582-3p 和 hsa-miR-582-5p在 Wnt信號通絡中顯著富集，且存在于轉錄因子調節網絡中；hsa-miR-665與MAPK信號通路密切相關。WT1和ETV1的轉錄因子分別由hsa-miR-657 和 hsa-miR-582-5p調控，并調控雄激素受體基因表達。miR-582-5p、miRNA-582-3p及miR-657可能在肺腫瘤的發展中起重要的調節作用。本研究探索了肺癌發病的新機制，助力新療法的發展。

圖1：RNA高通量測序數據熱圖
（A：病人組與正常組miRNA差異表達熱圖；B：病人組與正常組circRNA差異表達熱圖）

圖2：差異表達基因及miRNA相關通路富集分析

圖3：miRNA, circRNA, lncRNA及 mRNA競爭性內源RNA網絡互作圖
生物信息分析
原始數據質控檢查
比對結果質控檢查
基因覆蓋度分析
基于基因表達的樣品主成分分析
基因表達分析
差異基因表達分析
差異基因GO功能分析
差異基因KEGG通路分析
差異基因Rectome通路分析
針對mRNA基因的GSEA分析
circRNA預測及鑒定
circRNA差異分析
差異circRNA宿主基因的GO功能分析
差異circRNA宿主基因的KEGG通路分析
差異circRNA宿主基因的Rectome通路分析
差異circRNA的靶向miRNA預測分析
差異circRNA及靶向miRNA網絡調控制圖
長鏈非編碼RNA的識別
長鏈非編碼RNA差異分析
差異lncRNA順式調控基因的GO功能分析
差異lncRNA順式調控基因的KEGG通路分析
差異lncRNA順式調控基因的Rectome通路分析

可選分析
基因可變剪切分析（測序數據量為15Gb）

部分結果示例
圖1：差異基因及差異lncRNA的熱圖、火山圖

圖2：ceRNA調節網絡

圖3：差異表達的mRNA、lncRNA和circRNA的功能富集分析

圖4：單個可變剪切事件sashimi plot

圖5：可變剪切事件數目統計展示

Table1.RNA-seq原始樣本送樣建議

送樣類型	送樣量	備注
細胞(細胞數)	≥1*10^6	無支原體污染
動物組織	≥100mg
植物組織	≥100mg
全血	≥4mL
FFPE	8-10片，未染色，厚度10μm

Table2.RNA-seq RNA樣本送樣建議

送樣類型	送樣量	完整性（RIN值）	濃度	其他	純度
total RNA（組織、細胞、全血等）	≥1μg	≥7	≥100ng/μl		無DNA，蛋白/鹽離子等污染，樣本無色透明不粘稠
血清血漿、細胞上清、外泌體RNA	≥200ng，如≤10ng,則采用微量建庫	/	/
FFPE組織RNA	≥2μg	≥3	/	DV200>30%

*更具體的送樣方法請詳詢銷售或技術支持
物種范圍：人、小鼠、大鼠等哺乳動物，擬南芥、水稻、番茄、玉米、大豆等植物，其他物種詳詢銷售或技術支持

Q1：常規的細胞或組織樣本與血清/血漿、外泌體、FFPE等特殊樣本在做全轉錄組測序時數據質量是否有不同？
A1：會有不同。常規細胞或組織樣本抽提出來的RNA質量較高，建庫起始量足夠，測序數據質量較好，一般有效數據mapping率85%以上；而血清/血漿、外泌體、FFPE等特殊樣本RNA降解程度較高，濃度低，建庫起始量不足，測序數據質量較差，一般有效數據mapping率50%左右。

Q2：為什么常規全轉錄組測序要先去除rRNA？
A2：核糖體RNA的遺傳信息的保守性較高，在不同組織、器官中也十分穩定，研究者更傾向于研究信息含量更為豐富的mRNA、非編碼RNA以及circRNA等。在抽提所得的總RNA中，80%以上都是核糖體RNA，如采用Oligo dT磁珠捕獲mRNA則會丟失不含polyA尾的lincRNA、circRNA等。因此，采用去除rRNA的建庫方式能最大程度地保留轉錄組RNA信息，提高測序有效數據量。