RNA Immunoprecipitation （RIP）是研究細胞內RNA與蛋白結合的一種實驗技術，運用針對目標蛋白的抗體，把目的蛋白以及與之結合的RNA沉淀下來，經過分離純化就可以對復合物中的RNA進行 Microarray（RIP-chip），定量qPCR或高通量測序（RIP-Seq）檢測分析。本試劑包含RIP實驗所需的全套試劑，以及RIP產物的提取試劑，讓實驗更加輕松快捷。

RIP技術原理圖

產品特點

1.方便快捷：試劑盒成分完整，包含RIP和提取整套試劑，5小時即可完成。

2.體系穩定：捕獲效率高，實驗體系穩定，重復性高。

應用范圍

1.與目標蛋白結合的RNA及其他相互作用蛋白分析；

2.RBP結合RNA motif鑒定；

3.不適用膜結合蛋白、DNA結合蛋白（組蛋白、核仁蛋白等）的RIP實驗。

實驗流程

RIP實驗的目的是分析與目的蛋白結合的RNA，原理則是運用針對目的蛋白的抗體把相應的RNA-蛋白復合物沉淀下來，經過分離純化并對結合在復合物上的RNA進行測序或PCR分析。

2016年9月23日，意大利Maria R. Matarazzo教授在Methods in Molecular Biology雜志介紹了RIP實驗的經典操作方法。文中介紹的RIP實驗操作流程如下圖所示：

圖1. 經典RIP實驗操作流程（來自[1]）

而RIP實驗有哪些應用呢？大家都知道RNA是一種不穩定的生物大分子，絕大多數RNA都需要與特定的RNA結合蛋白形成RNA-蛋白復合物才能穩定存在于細胞中。RNA-蛋白復合物驅動了幾乎所有細胞過程的基因表達的轉錄后調控，包括剪接（splicing）、出核轉運（nuclear export）、mRNA穩定性以及蛋白轉譯過程。因此，對基因調控的了解就有賴于確定這些過程中RNA的結合的變化，RIP技術應運而生，可應用于研究miRNA調節靶點、RNA與RNP（RNA結合蛋白）的互作關系等。

案例1

RIP用于研究circRNA與蛋白互作

2022年3月29號，重慶醫科大學的陳俊霞教授在Mol Cancer發表文章Hypoxia-induced circWSB1 promotes breast cancer progression through destabilizing p53 by interacting with USP10，本研究揭示了一種新的機制，即缺氧誘導的circWSB1可以與USP10相互作用，從而減弱USP10介導的p53穩定并促進BC的進展，為BC提供了一種替代的預后生物標記物和治療靶點。

圖2

已有報道發現，環狀RNA通過miRNA海綿機制參與缺氧的調控。幾乎所有這些與缺氧相關的circRNA都起到了miRNA海綿的作用，環狀RNA同樣可以通過結合蛋白以及翻譯多肽發揮功能。作者使用pull-down對環狀RNA的結合產物進行分析，雖然沒有發現P53，但是作者發現泛素化酶USP10與circWBS1相互結合。使用數據庫對二者的結合位點進行了預測。設計USP10的全長和缺失突變體并插入Flag標簽（圖3），通過RIP實驗（使用吉賽生物RIP試劑盒）對USP10與circWBS1的結合進行了驗證。

圖3

案例2

RIP用于研究lncRNA與蛋白互作

圖4. lncRNA和編碼RNA與EZH2結合能力的比較（來自[3]）

在本研究中，使用EZH2特異性抗體對人胃癌細胞系MKN45和AGS，以及對照細胞系GES-1進行RIP-seq，分析了8256個與EZH2相關的RNAs，包括編碼和非編碼RNAs，其中MALAT1在MKN45細胞系中高表達。并且發現MALAT1通過和EZH2相互作用，抑制原鈣黏蛋白因子10（PCDH10）的表達，從而促進胃癌細胞的侵襲和轉移[3]。

案例3

RIP用于研究miRNA與蛋白互作

圖5. 缺鐵性和非缺血性NPCs中isomiRs分析（來自[4]）

在本研究中，利用Ago2 RIP-seq，分析非缺血性和缺血性成年大鼠側腦室下區（SVZ）的神經祖細胞（NPCs）miRNAs的表達情況[4]。

結果顯示，相較于非缺血性NPCs，中風改變了NPCs中Ago2相關的miRNAs表達，缺血性NPCs中的isomiRsreads數增加，其中5'末端添加核苷酸的isomiR-142-5p_L+2R-1顯著上調，5'末端缺失核苷酸的isomiR-187-5p_L-2R+3顯著下調[4]。

案例解析參考文獻

[1] RIP: RNA Immunoprecipitation.Methods Mol Biol, 2016. 1480: p. 73-86.

[2] Hypoxia-induced circWSB1 promotes breast cancer progression through destabilizing p53 by interacting with USP10[J]. Molecular Cancer, 2022, 21(1):1-20.

[3] MALAT1 long ncRNA promotes gastric cancer metastasis by suppressing PCDH10.Oncotarget. 2016 Mar 15; 7(11): 12693–12703.

[4] Identification of miRNomes associated with adult neurogenesis after stroke using Argonaute 2-based RNA sequencing.RNA Biol. 2017; 14(5): 488–499.

[1] IF27.401 The circACTN4 interacts with FUBP1 to promote tumorigenesis and progression of breast cancer by regulating the expression of proto-oncogene MYC. Molecular Cancer

[2] IF17.388 N6-methyladenosine reader IMP2 stabilizes the ZFAS1/OLA1 axis and activates the Warburg effect: implication in colorectal cancer. Journal of Hematology & Oncology

[3] IF14.919 The genomic landscape of cholangiocarcinoma reveals the disruption of post-transcriptional modifiers. Nature Communications

[4] IF11.161 A novel lncRNA ARST represses glioma progression by inhibiting ALDOA-mediated actin cytoskeleton integrity. JOURNAL OF EXPERIMENTAL & CLINICAL CANCER RESEARCH

[5] IF9.261 Mettl14 mediates the inflammatory response of macrophages in atherosclerosis through the NF-κB/IL-6 signaling pathway. CELLULAR AND MOLECULAR LIFE SCIENCES

[6] IF8.886 ac4C acetylation of RUNX2 catalyzed by NAT10 spurs osteogenesis of BMSCs and prevents ovariectomy-induced bone loss. Molecular Therapy-Nucleic Acids

[7] IF8.718 The m6A reader IGF2BP3 promotes acute myeloid leukemia progression by enhancing RCC2 stability. EXPERIMENTAL AND MOLECULAR MEDICINE

[8] IF8.679 IGF2BP2-dependent activation of ERBB2 signaling contributes to acquired resistance to tyrosine kinase inhibitor in differentiation therapy of radioiodine-refractory papillary thyroid cancer. CANCER LETTERS

[9] IF8.469 A novel 3’tRNA-derived fragment tRF-Val promotes proliferation and inhibits apoptosis by targeting EEF1A1 in gastric cancer. Cell Death & Disease

[10] IF8.469 SF3B4 promotes ovarian cancer progression by regulating alternative splicing of RAD52. Cell Death & Disease

[11] IF8.469 Linc-ROR facilitates progression and angiogenesis of hepatocellular carcinoma by modulating DEPDC1 expression. Cell Death & Disease

[12] IF8.469 A new candidate oncogenic lncRNA derived from pseudogene WFDC21P promotes tumor progression in gastric cancer. Cell Death & Disease

[13] IF8.469 HNRNPA1-mediated exosomal sorting of miR-483-5p out of renal tubular epithelial cells promotes the progression of diabetic nephropathy-induced renal interstitial fibrosis. Cell Death & Disease

1. 可以做膜蛋白或核蛋白的RIP嗎？

為了不影響內源蛋白與RNA的互作，RIP裂解液裂解作用較溫和。已有實驗實例證明，RIP裂解液可以裂解開胞膜及核膜，釋放胞內及核內蛋白，但與DNA及細胞膜緊密結合的蛋白無法裂解釋放出來，因此不適用于DNA與膜結合的蛋白RIP。

2. 為什么RIP試劑盒提出來的RNA濃度很低，正常嗎？

RIP產物量一般都不足以直接測量出濃度，可通過定量RT-PCR（如果已知RBP的結合靶基因），或通過測序技術進行分析。

做qPCR分析時，由于RNA濃度未知，可取所用反轉錄體系的最大上樣量進行逆轉錄。測序時，如一次實驗產物量不夠建庫，可重復實驗，合并產物，也可適當提高初始樣本量。

3. 試劑盒RIP RNA產物分析是定量還是半定量式分析？

是半定量分析，以Ip、Igg組相對表達差異倍數來判斷是否有結合作用。

4. RIP說明書說的5ug抗體是怎么計算的？

抗體說明書中有質量濃度的話可以進行換算。如無，可按說明書中建議的體積量使用。

5. 在RIP實驗中，IP和WB使用的抗體需要來源于不同的種屬嗎？

在RIP實驗中，IP和WB使用的抗體最好來源于不同的種屬，否則在跑WB時，會在55KD和25KD的位置出現較強的重鏈和輕鏈，影響目的蛋白的曝光。

詳細內容可參考：

如何避免IP檢測過程中的重鏈干擾與輕鏈干擾_中國生物器材網 (bio-equip.com)

如何避免免疫共沉淀(Co-immunoprecipitation, Co-IP)中的igG交叉污染 - 百度文庫 (baidu.com)

6. RIP中蛋白提取步驟中用到的丙酮有替代品嗎?

丙酮適用本試劑盒說明書中的實驗操作。客戶也可用其它方法進行蛋白沉淀提取。

7. BufferE加入β-巰基乙醇后出現白色絮狀沉淀，正常嗎？

正常。室溫平衡一會即可，即使仍有白色沉淀也不影響使用。

8. RIP結果WB檢測正常，IP、Igg兩組ct值幾乎無差異說明什么？

說明目的蛋白與目標基因無特異性結合。

9. RIP試劑盒適用于裂解細菌嗎？

細菌樣本用液氮速凍研磨后，再進行這些裂解步驟即可。

10. MeRIP和RIP技術或試劑盒可以通用嗎？

MeRIP和RIP，雖然核心原理一樣，但兩個技術的實驗方法、流程、所用抗體以及應用都是不一樣的，不能通用。

了解更多：

https://mp.weixin.qq.com/s/S84RXllkC0CegN61EZ84hA

https://mp.weixin.qq.com/s/520lOrEJrqZV7XutP4KE_Q