第五代circRNA過表達載體有pCD5-ciR、pCD25-ciR、pLO5-ciR、pLC5-ciR、pK5ssAAV-ciR和pK25ssAAV-ciR，能滿足普通真核表達、慢病毒包裝和腺相關病毒（AAV）包裝等多種用途。載體均攜帶優化過的側翼成環框架，含有精心改造的Alu元件、QKI等RBP的結合位點，并使用全新設計的環化介導序列，能保證插入的circRNA準確高效環化。

第五代circRNA過表達載體的主要特點

1.環化準確性更高。全新設計的成環框架和環化介導序列，在保證高效率過表達的前提下環化準確性更高，比上代載體準確環化成功率提高60%。

2.穩定性更高。對長度小于200 nt或大于2000 nt的circRNA準確高效過表達成功率更高，比上代載體成功率提高30%。

3.通用性更強。提升對非天然circRNA序列的支持，插入任意一段序列也可以準確高效成環，比上代載體成功率提高50%。

4.可移植性更高。6個載體全部預留最常用的EcoRI和BamHI酶切位點，不同載體間轉換更方便。

吉賽推出了升級的第五代circRNA過表達載體，有pCD5-ciR、pCD25-ciR、pLO5-ciR、pLC5-ciR、pK5ssAAV-ciR和pK25ssAAV-ciR，使用時只需要克隆circRNA的序列（線性化）進載體中，和常規的載體構建一模一樣，相對簡便省事。能滿足普通真核表達、慢病毒包裝和腺相關病毒（AAV）包裝等多種用途，優點有環化準確性更高、穩定性更高、通用性更強和可移植性更高。

案例1

2020年9月14日，中山大學孫逸仙紀念醫院蘇士成教授合作團隊在Cell雜志（IF 41.584)上發表了題為Targeting Mitochondria-Located circRNA SCAR Alleviates NASH via Reducing mROS Output的文章，該文章應用Arraystar Human CircRNA芯片篩選鑒定出與非酒精性脂肪性肝炎發生相關的環狀RNA分子SCAR，并發現在線粒體中過表達circRNA SCAR能夠抑制肝臟成纖維細胞的活化與相應的炎癥反應，敲低則有相反的表型。并且作者使用吉賽公司過表達載體 pcD-ciR 通過插入3×flag標簽以及預測的ORF序列（圖1），發現circRNA SCAR無法編碼蛋白質，隨后作者通過一系列實驗發現該circRNA能夠直接與ATP5B結合并發揮生物學功能[1]。作者團隊發現了線粒體circRNA的重要功能并發展了一系列相關的實驗方法，為免疫代謝疾病提供了一種有吸引力的治療策略。

案例2

南京醫科大學王美林教授，杜牧龍副教授和劉凌翔主任醫師共同通訊在Molecular Cancer雜志在線發表文章Exosomal circLPAR1 functions in colorectal cancer diagnosis and tumorigenesis through suppressing BRD4 via METTL3–eIF3h interaction，本研究強調了血漿外泌體中的circLPAR1在結直腸癌診斷中是一個有前途的預測因子，并描述了其對結直腸癌發生的生物學調節。為臨床早期診斷和疾病發展的發病機制研究提供了新的視角。

圖1. 使用 MS2 標記系統的 circLPAR1 下拉實驗

本研究中，作者使用circRNA pull-down技術進行circRNA下拉試驗，進而對下拉蛋白產物進行質譜分析。CircRNA pull-down技術是使用帶有MS2捕獲蛋白（MS2-CP）的circRNA下拉分析來確定與circLPAR1相關的RNA結合蛋白（RBPs）。如圖2所示，該技術是在吉賽生物專利技術circRNA過表達載體基礎上，將RNA標簽體系引入circRNA中，通過RNA標簽和捕獲蛋白的高度特異且穩定相互作用，進行靶分子捕獲和相互作用分子的捕獲。[2]

案例解析參考文獻：

[1] Qiyi Zhao, Jiayu Liu, Hong Deng, et al. Targeting Mitochondria-Located circRNA SCAR Alleviates NASH via Reducing mROS Output.Cell (2020), https://doi.org/10.1016/j.cell.2020.08.009

[2] Shanyue Tan, et al. Exosomal circLPAR1 functions in colorectal cancer diagnosis and tumorigenesis through suppressing BRD4 via METTL3–eIF3h interaction   Mol Cancer.(2022); doi: 10.1186/s12943-021-01471-y

1、Qiyi Zhao, Jiayu Liu, Hong Deng, et al. Targeting Mitochondria-Located circRNA SCAR Alleviates NASH via Reducing mROS Output.Cell (2020), https://doi.org/10.1016/j.cell.2020.08.009

2、Rui Zheng,#1,2 Ke Zhang,#3 Shanyue Tan, et al. Exosomal circLPAR1 functions in colorectal cancer diagnosis and tumorigenesis through suppressing BRD4 via METTL3–eIF3h interaction   Mol Cancer.( 2022); doi: 10.1186/s12943-021-01471-y

1、circRNA過表達怎么做？

CircRNA的形成和線性RNA不同，因此對circRNA的過表達不能直接將序列連接到常規的真核表達載體（如pcDNA3.1）來進行。已明確的circRNA形成依賴于側翼序列中的反向互補序列（RCMs，如Alu元件）或與能調控circRNA生成的蛋白（如QKI）的結合位點，因此構建載體時可以在circRNA序列上下游分別增加一段反向互補的序列，質粒轉染細胞后會先轉錄出上游+circRNA+下游的線性RNA鏈，再依靠長下游的反向互補配對促使成環。

2、 circRNA過表達成功標準？

載體構建好后瞬時轉染細胞進行RT-PCR檢測以驗證過表達效率。

1）qPCR檢測有過表達倍數，質粒瞬轉效率高，基因本底豐度不太高的話一般都可以過表達50倍以上；

2）使用Divergent引物檢測過表達的PCR產物是大小正確的單一條帶，PCR產物進行sanger測序確定成環序列準確。滿足這兩個條件才可以認為載體實現了對circRNA的準確高效率過表達。