服務介紹
RNA作為生物體內的遺傳信息載體,根據結構和功能的不同分為信使RNA(Messenger RNA,mRNA)和非編碼(Non-coding RNA,ncRNA),在基因調控層面,這些RNA分子起到了至關重要的作用。
吉賽生物研發的第五代RNA過表達載體可對mRNA/lncRNA/circRNA分子實現精準表達,能滿足普通真核表達、慢病毒包裝和腺相關病毒(AAV)包裝等多種用途。其中circRNA載體均攜帶優化過的側翼成環框架,含有精心改造的Alu元件、QKI等RBP的結合位點,并使用全新設計的環化介導序列,使插入的circRNA準確高效環化,mRNA及lncRNA表達載體攜帶強啟動子及KOZAK序列,使mRNA/lncRNA精準正確表達。
過表達分子類型 | 載體名稱 | 抗性 | 熒光標記 | 應用 | ||
瞬轉細胞 | 包裝慢病毒 | 包裝腺相關AAV病毒 | ||||
circRNA | pCD5-ciR | AmpR | 無 | √ | × | × |
pCD25-ciR | AmpR | eGFP | √ | × | × | |
pLO5-ciR | AmpR/PuroR | 無 | √ | √ | × | |
pLC5-ciR | AmpR/PuroR | eGFP | √ | √ | × | |
pK5ssAAV-ciR | AmpR | 無 | √ | × | √ | |
pK25ssAAV-ciR | AmpR | eGFP | √ | × | √ | |
mRNA&lncRNA | pCDNA3.1 | AmpR | 無 | √ | × | × |
pCDH | AmpR | eGFP | √ | √ | × | |
ssAAV.CMV.EGFP.WPREs | AmpR | eGFP | √ | × | √ |
技術優勢
1. 過表達效率高;
2. 特異性強、準確率高:優化篩選過的表達元件有效保證目標RNA分子的序列準確表達;
3. 穩定性高:mRNA、lncRNA(100-3000nt序列);circRNA(200-2500nt序列)均能實現準確高效過表達;
4. 適用范圍廣:可用于細胞轉染、包裝慢病毒或腺相關病毒,同時可提供GFP綠色熒光蛋白標記和嘌呤霉素抗性基因標記,適用于客戶不同的實驗需求。
服務流程
1. 載體構建;
2. 瞬時轉染;
3. 特異性引物設計合成;
4. RT-qPCR驗證;
5. Sanger測序驗證;
6. 病毒包裝(可選,列于病毒包裝項目)
客戶提供
1. 基因ID/物種/全長序列
2. 載體名稱
我們提供
1. 目的載體:10μg質粒+200μL甘油菌/對照載體:10μg質粒+200μL甘油菌;
2. 載體構建與驗證實驗報告:
① 載體構建步驟;
② 載體測序驗證結果原始文件;
③ 細胞轉染實驗步驟;
④ qPCR實驗流程方案及產物測序;
⑤ 載體構建與驗證實驗報告。
案例1:
2020年9月14日,中山大學孫逸仙紀念醫院蘇士成教授合作團隊在Cell雜志(IF 41.584)上發表了題為Targeting Mitochondria-Located circRNA SCAR Alleviates NASH via Reducing mROS Output的文章,該文章應用Arraystar Human CircRNA芯片篩選鑒定出與非酒精性脂肪性肝炎發生相關的環狀RNA分子SCAR,并發現在線粒體中過表達circRNA SCAR能夠抑制肝臟成纖維細胞的活化與相應的炎癥反應,敲低則有相反的表型。并且作者使用吉賽公司過表達載體 pcD-ciR 通過插入3×flag標簽以及預測的ORF序列(圖1),發現circRNA SCAR無法編碼蛋白質,隨后作者通過一系列實驗發現該circRNA能夠直接與ATP5B結合并發揮生物學功能[1]。作者團隊發現了線粒體circRNA的重要功能并發展了一系列相關的實驗方法,為免疫代謝疾病提供了一種有吸引力的治療策略。
參考文獻:
Qiyi Zhao, Jiayu Liu, Hong Deng, et al. Targeting Mitochondria-Located circRNA SCAR Alleviates NASH via Reducing mROS Output.Cell (2020), https://doi.org/10.1016/j.cell.2020.08.009
案例2:
參考文獻:
Song R, Ma S, Xu J, Ren X, Guo P, Liu H, Li P, Yin F, Liu M, Wang Q, Yu L, Liu J, Duan B, Rahman NA, Wo?czyński S, Li G, Li X. A novel polypeptide encoded by the circular RNA ZKSCAN1 suppresses HCC via degradation of mTOR. Mol Cancer. 2023 Jan 23;22(1):16. doi: 10.1186/s12943-023-01719-9. PMID: 36691031; PMCID:PMC9869513.
qRT-PCR檢測
圖1 hsa_circ_00AAAAA的相對表達差異
表1 hsa_circ_00AAAAA的相對表達量
qPCR產物測序結果:
注:hsa_circ_00AAAAA在circBase中的環化位點序列GATTATGGAAACAGCTTTTTATAACTATGATG
結論:
相比于對照組,CAAAAA組的過表達倍數為***;PCR產物測序峰圖正常,無雜峰或疊帶,序列與環化位點參考序列對比吻合。以上結果表明CAAAAA能在真核細胞中成功過表達目的hsa_circ_00AAAAA。
1. circRNA過表達怎么做?
CircRNA的形成和線性RNA不同,因此對circRNA的過表達不能直接將序列連接到常規的真核表達載體(如pcDNA3.1)來進行。已明確的circRNA形成依賴于側翼序列中的反向互補序列(RCMs,如Alu元件)或與能調控circRNA生成的蛋白(如QKI)的結合位點,因此構建載體時可以在circRNA序列上下游分別增加一段反向互補的序列,質粒轉染細胞后會先轉錄出上游+circRNA+下游的線性RNA鏈,再依靠長下游的反向互補配對促使成環。
2. circRNA過表達成功標準?
載體構建好后瞬時轉染細胞進行RT-PCR檢測以驗證過表達效率。
1)qPCR檢測有過表達倍數,質粒瞬轉效率高,基因本底豐度不太高的話一般都可以過表達50倍以上;
2)使用Divergent引物檢測過表達的PCR產物是大小正確的單一條帶,PCR產物進行sanger測序確定成環序列準確。滿足這兩個條件才可以認為載體實現了對circRNA的準確高效率過表達。