服務(wù)介紹

Nanopore cDNA-PCR測(cè)序是指基于牛津納米孔公司（Oxford Nanopore Technologies，ONT）三代測(cè)序平臺(tái)進(jìn)行全長轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，無需打斷，可直接讀取從5’端到3’端polyA尾的高質(zhì)量單個(gè)RNA分子全長序列，準(zhǔn)確辨別二代測(cè)序無法準(zhǔn)確識(shí)別的可變剪接（AS）、融合基因、lncRNA及其靶基因，且可同時(shí)對(duì)基因和轉(zhuǎn)錄本進(jìn)行定量分析。ONT全長轉(zhuǎn)錄組已廣泛應(yīng)用于生長發(fā)育、環(huán)境適應(yīng)、免疫互作、突變表型、腫瘤的發(fā)生、臨床診斷和藥物研發(fā)等領(lǐng)域。

Nanopore cDNA-PCR測(cè)序流程圖

測(cè)序方案

測(cè)序模式：Nanopore Sequencing

測(cè)序數(shù)據(jù)量：4Gb/樣，or 6Gb/樣

技術(shù)優(yōu)勢(shì)

1. Nanopre全長轉(zhuǎn)錄組測(cè)序無需打斷RNA，可獲得5’到3’全長轉(zhuǎn)錄本序列及其表達(dá)信息，對(duì)片段大小無偏好，直接檢測(cè)電信號(hào)無需邊合成邊測(cè)序其GC偏好性遠(yuǎn)低于二代平臺(tái)；

2. 由于無需拼接其在轉(zhuǎn)錄本層面的結(jié)構(gòu)變異檢測(cè)方面，比如可變剪接、融合基因、APA、新基因預(yù)測(cè)等具有絕對(duì)優(yōu)勢(shì)；

3. 除了可準(zhǔn)確鑒別轉(zhuǎn)錄本結(jié)構(gòu)變異，還可實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄本（mRNA或polyA+ lncRNA）表達(dá)水平準(zhǔn)確定量。

Nanopore long-read RNAseq reveals widespread transcriptional variation among the surface receptors of individual B cells

發(fā)表雜志：Nature Communications

影響因子：12.121

短reads RNAseq解析復(fù)雜isoform的能力有限，因?yàn)樗鼰o法測(cè)序RNA分子的全長cDNA拷貝。作者研究了使用長讀取單分子Oxford Nanopore測(cè)序儀的RNAseq是否能夠在不犧牲準(zhǔn)確的基因表達(dá)定量的情況下，鑒定和定量復(fù)雜的isoform。在小鼠B1a細(xì)胞中鑒定了數(shù)千個(gè)未注釋的轉(zhuǎn)錄起始和終止位點(diǎn)，以及數(shù)百個(gè)可變剪接事件，鑒定了在B1a細(xì)胞中表達(dá)的數(shù)百種基因，這些基因顯示出多種復(fù)雜的isoform，包括幾種B細(xì)胞特異性表面受體。本研究表明，可以在單細(xì)胞水平上識(shí)別和定量復(fù)雜的isoform。

圖1 ONT RNAseq數(shù)據(jù)分析確定小鼠B1a細(xì)胞的異構(gòu)體特征

圖2 揭示B細(xì)胞表面受體的異構(gòu)體多樣性

生信分析

ONT原始數(shù)據(jù)質(zhì)控

比對(duì)結(jié)果質(zhì)控檢查

轉(zhuǎn)錄本定量

差異轉(zhuǎn)錄本鑒定

轉(zhuǎn)錄因子預(yù)測(cè)

功能注釋

富集分析

蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)

可變剪接分析

融合轉(zhuǎn)錄本

新轉(zhuǎn)錄本發(fā)現(xiàn)

基因結(jié)構(gòu)優(yōu)化

Table. Nanopore cDNA-PCR Sequencing樣本送樣建議