服務(wù)介紹

熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)是指以熒光素為底物來檢測熒光素酶活性的一種報(bào)告基因系統(tǒng)，通過熒光測定儀檢測該報(bào)告基因系統(tǒng)中釋放的生物熒光，從而反映基因是否存在靶向互作。

技術(shù)優(yōu)勢

1. 靈敏度高，比Western blot靈敏度高1000倍以上；

2. 內(nèi)源性低，哺乳動物無內(nèi)源性表達(dá)；

3. 熒光素酶檢測不受細(xì)胞內(nèi)其他物質(zhì)影響；

4. 發(fā)光檢測，檢測方便；

5. 檢測范圍廣；

6. 采用瞬時(shí)轉(zhuǎn)染技術(shù)，操作簡便、快速，周期短，適用于絕大多數(shù)細(xì)胞類型。

客戶提供

1. circRNA可提供circBase/circBank ID；mRNA/lncRNA可提供轉(zhuǎn)錄本ID（如NCBI編號NM_001126113.2）；

2. 結(jié)合位點(diǎn)信息：預(yù)測結(jié)合位點(diǎn)圖片或文檔（具體序列）；

3. 檢測使用的細(xì)胞；

4. 雙熒光素酶檢測的分組信息。

我們提供

1. 質(zhì)粒10μg+菌液200μl；

2. 載體構(gòu)建+雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)報(bào)告；

3. 剩余的模擬物。

模擬物與靶基因作用情況

抑制劑與靶基因作用情況

1、雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)檢測數(shù)值太低是什么原因？

正常表達(dá)水平下，熒光值的數(shù)量級應(yīng)在10 4次方-10 7次方數(shù)量級左右，導(dǎo)致數(shù)值低主要有以下幾個(gè)原因：啟動子活性、轉(zhuǎn)染效率低、裂解不充分、底物失效、操作不規(guī)范等原因，具體的原因需要實(shí)驗(yàn)者進(jìn)行排查。

1.1 轉(zhuǎn)染效率低

a. 優(yōu)化轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)條件，用較易轉(zhuǎn)染的質(zhì)粒做陽性對照（如轉(zhuǎn)染過表達(dá)熒光蛋白質(zhì)粒）；

b. 確保轉(zhuǎn)染DNA的質(zhì)量，可通過酶切或瓊脂糖凝膠電泳的方法對DNA質(zhì)量進(jìn)行鑒定；

c. 選擇活性較高，處于指數(shù)分裂期的細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染。

1.2 啟動子活性低或誘導(dǎo)失敗

a. 轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞培養(yǎng)使用特異性誘導(dǎo)啟動子的條件；

b. 優(yōu)化細(xì)胞的培養(yǎng)條件，提高熒光素酶的表達(dá)量；

c. 更換強(qiáng)啟動子（如SV40、CMV）。

注：海腎熒光素酶基因作為內(nèi)對照，其表達(dá)應(yīng)不受時(shí)期、部位、環(huán)境影響，因此常用組成型表達(dá)的TK啟動子。

1.3 樣品裂解效率低

a. 細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)間不宜過長，12-36h內(nèi)最好，長時(shí)間培養(yǎng)后，細(xì)胞可能會難裂解。

b. 加入的裂解液需足量，保證細(xì)胞能夠充分裂解。

1.4 檢測過程操作不規(guī)范

a. 選擇合適的檢測儀器，能夠檢測化學(xué)發(fā)光或者生物發(fā)光的儀器都適用于該實(shí)驗(yàn)；

b. 需加入足量底物，保證底物的飽和，否則會造成檢測結(jié)果出現(xiàn)很大偏差；

c. 室溫反應(yīng)。反應(yīng)時(shí)各個(gè)組分（細(xì)胞裂解產(chǎn)物，底物工作液等）都需要調(diào)整到室溫；

d. 熒光素酶的半衰期一般約30min，加完底物后可立即檢測，盡量在30min內(nèi)完成裂解。

1.5 底物氧化失效

a. 底物避光密封保存，螢火蟲熒光素酶底物-20℃保存；海腎熒光素酶底物推薦-80℃保存；

b. 反應(yīng)工作液建議現(xiàn)用現(xiàn)配。

2、雙熒光素酶熒光值過高的原因？

熒光值過高可能會超出儀器檢測范圍，從而檢測不到值，一般讀數(shù)在5-6位之間較好。熒光值過高可通過以下方式嘗試解決：

a. 減少質(zhì)粒轉(zhuǎn)染量；

b. 細(xì)胞樣品裂解后，離心取上清后檢測或?qū)α呀猱a(chǎn)物進(jìn)行稀釋后檢測。

注：不建議通過減少底物量來降低熒光值，需要保證底物的飽和來反映熒光素酶真實(shí)的表達(dá)水平，否則會造成檢測結(jié)果出現(xiàn)大的偏差。

3、雙熒光素酶復(fù)孔差異大怎么辦？

雙報(bào)告基因檢測系統(tǒng)較為靈敏，檢測結(jié)果受多種因素的影響，因此，一般設(shè)置3個(gè)或3個(gè)以上的復(fù)孔，復(fù)孔之間有差異是正常的，差異在同一個(gè)數(shù)量級可以接受。想要得到更準(zhǔn)確的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，需盡量減少復(fù)孔的差異性，建議如下：

1、裂解后建議離心取上清，保證樣本均一性；

2、保證加樣的準(zhǔn)確性；

3、樣品和底物混合后到檢測前的時(shí)間以及檢測時(shí)間應(yīng)控制在相同的時(shí)間內(nèi)。