服務(wù)介紹

RNA免疫沉淀（RIP）利用針對(duì)目標(biāo)蛋白質(zhì)的抗體把相應(yīng)的RNA-蛋白質(zhì)復(fù)合物沉淀下來(lái)，經(jīng)過(guò)分離純化并對(duì)結(jié)合在復(fù)合物上的RNA進(jìn)行測(cè)序或qPCR分析。RIP可應(yīng)用于研究miRNA調(diào)節(jié)靶點(diǎn)、RNA與RBP（RNA結(jié)合蛋白）的互作關(guān)系等。

RIP技術(shù)原理

技術(shù)優(yōu)勢(shì)

1. 核酸和蛋白實(shí)驗(yàn)兼做，結(jié)果可靠；

2. 自主研發(fā)RIP試劑盒，暢銷國(guó)內(nèi)市場(chǎng)，效果有保證。

客戶提供

1. 新鮮細(xì)胞/組織樣本（組織≥100mg，細(xì)胞不少于1E+7個(gè)），細(xì)胞須保證無(wú)支原體污染；

2. IP級(jí)別抗體和抗體信息；

3. qPCR檢測(cè)基因信息：物種、基因名稱、長(zhǎng)度和序列等，指定具體轉(zhuǎn)錄本（例如NCBI編號(hào)NM_001126113.2）；

4. RIP產(chǎn)物的其他檢測(cè)項(xiàng)目（RIP-seq或者IP蛋白樣本質(zhì)譜）。

我們提供

1. RIP實(shí)驗(yàn)報(bào)告（方法、流程，結(jié)果）；

2. RIP剩余產(chǎn)物。

案例1

參考文獻(xiàn)：

Bai D, Zhao J, Wang R, Du J, Zhou C, Gu C, Wang Y, Zhang L, Zhao Y, Lu N. Eubacterium coprostanoligenes alleviates chemotherapy-induced intestinal mucositis by enhancing intestinal mucus barrier. Acta Pharm Sin B. 2024 Apr;14(4):1677-1692. doi: 10.1016/j.apsb.2023.12.015. Epub 2023 Dec 30. PMID: 38572095; PMCID: PMC10985029.

案例2

參考文獻(xiàn)：

Xu L, Ma X, Zhang X, Zhang C, Zhang Y, Gong S, Wu N, Zhang P, Feng X, Guo J, Zhao M, Ren Z, Zhang P. hsa_circ_0007919 induces LIG1 transcription by binding to FOXA1/TET1 to enhance the DNA damage response and promote gemcitabine resistance in pancreatic ductal adenocarcinoma. Mol Cancer. 2023 Dec 4;22(1):195. doi: 10.1186/s12943-023-01887-8. Erratum in: Mol Cancer. 2024 Jan 16;23(1):16. PMID: 38044421; PMCID: PMC10694898.

以anti-SNRNP70為目的抗體，anti-IgG為對(duì)照抗體，在Hela細(xì)胞裂解樣本中，進(jìn)行免疫沉淀。免疫沉淀所得蛋白質(zhì)樣品，進(jìn)行Western blot檢測(cè)，Input樣本與目的樣本在約70KDa大小位置有明顯條帶，陰性對(duì)照樣本無(wú)條帶。

免疫沉淀所得RNA逆轉(zhuǎn)成cDNA后，以U1 snRNA特異性引物，進(jìn)行qPCR分析，RIP組相對(duì)表達(dá)顯著高于IgG組，指示SNRNP70富集U1 snRNA。

Western blot檢測(cè)SNRNP70：

qPCR檢測(cè)U1 snRNA：

1. RIP送樣里細(xì)胞需要量是1E7的細(xì)胞量，是必須要達(dá)到1?10的7次方的細(xì)胞量嗎？

我們推薦用7次方進(jìn)行，這種內(nèi)源結(jié)合本來(lái)就只能結(jié)合少量的蛋白和RNA，如果最開(kāi)始的細(xì)胞量少，結(jié)合下來(lái)的物質(zhì)可能會(huì)更少。

2.RIP實(shí)驗(yàn)產(chǎn)物能否進(jìn)行去線性，進(jìn)行circRNA建庫(kù)？

如果客戶RIP捕獲前已經(jīng)打斷了RNA，這直接可以判斷，不能去線性

如果捕獲產(chǎn)物中RNA的片段化程度比較高，不建議用去線性的方法測(cè)circRNA。

一般RIP測(cè)序，都是建議用去rRNA鏈特異的方面進(jìn)行建庫(kù)測(cè)序。

3.RIP結(jié)果WB檢測(cè)正常，Input、IP、Igg三組ct值幾乎無(wú)差異說(shuō)明什么？

說(shuō)明目的蛋白與檢測(cè)基因無(wú)特異性結(jié)合。

4.為什么RIP實(shí)驗(yàn)前要做WB預(yù)實(shí)驗(yàn)評(píng)估？

做WB預(yù)實(shí)驗(yàn)主要目的：

①　檢測(cè)抗體的特異性，是否能結(jié)合目的蛋白；

②　檢測(cè)樣本中目的蛋白是否有表達(dá)及豐度水平；

③　總之，檢測(cè)該樣本能否滿足做RIP實(shí)驗(yàn)的最基本條件。

④　RIP預(yù)實(shí)驗(yàn)做的是WB檢測(cè)，跟我們平常理解的預(yù)實(shí)驗(yàn)不太一樣，這是探索性實(shí)驗(yàn)，預(yù)實(shí)驗(yàn)的目的是檢測(cè)這個(gè)實(shí)驗(yàn)的基本條件。

5. 我的抗體做WB都有目的蛋白條帶的，為啥做RIP就沒(méi)條帶了？

免疫試驗(yàn)有很多，但實(shí)驗(yàn)?zāi)康牟灰粯樱?/font>WB、ELISA、IP、IF、ChIP、IHC(P)、FACS，其中只有WB是一種需要將蛋白質(zhì)變性的實(shí)驗(yàn)，用強(qiáng)烈的蛋白變性劑SDS和β巰基乙醇，將蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)全部抹去，這種情況下任何一種該蛋白的抗體都能識(shí)別WB實(shí)驗(yàn)中變成直線狀態(tài)的抗原；但能做WB的抗體就不一定能用來(lái)做非變性試驗(yàn)IP、IF、IHC了，因?yàn)樘烊坏鞍椎娜S結(jié)構(gòu)隱藏了很多抗體結(jié)合位點(diǎn)，WB級(jí)別的抗體無(wú)法與之結(jié)合。做RIP實(shí)驗(yàn)，需要選購(gòu)IP級(jí)別的抗體。

6. 在RIP實(shí)驗(yàn)中，為什么IP和WB使用的抗體需要來(lái)源于不同的種屬？

在RIP實(shí)驗(yàn)中，IP和WB使用的抗體需要來(lái)源于不同的種屬，否者在跑WB時(shí)，會(huì)在55KD和25KD的位置出現(xiàn)較強(qiáng)的重鏈和輕鏈，影響目的蛋白的曝光。