撰文：EP編輯：circRNA

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研究背景

通過遞送編碼蛋白質的RNA，實現異位蛋白質功能是一種新的治療策略。而環狀RNA（circRNA）是一種最先進的延長RNA功能的策略。circRNA體外制備可以利用化學或酶連接方法，以及目前流行的利用I族內含子的RNA自剪接的circRNA形成策略。

基于RNA剪接的環化策略可以在體外和體內產生大量circRNA，但由于剪接需消耗一定RNA序列長度。盡管GTP和Mg2+在體外加速PIE剪接，但剪接后的小副產物RNA仍需要額外的去除步驟。

2024年8月4日，中國臺灣國家衛生研究院余佳益研究團隊在Nature Communications雜志在線發表研究論文：A cis-acting ligase ribozyme generates circular RNA in vitro for ectopic protein functioning。該研究利用系統篩選順式連接酶核酶(RzL)體外合成circRNA，并針對合成的circRNA進行一系列驗證表明，一個內部核糖體進入位點(IRES)使circRNA能夠翻譯，但兩個順式的IRES阻礙了翻譯。加上特異的引導RNA，表達核糖核酸酶Cas13的circRNA顯示出對抗相應RNA病毒的良好潛力，進一步拓寬了circRNA的應用。

一、PIE剪接策略合成RNase R抗性circRNA，可利用RT-PCR量化

首先，研究利用傳統PIE策略建立circRNA的生產、鑒定和量化平臺，但也留意到剪接反應中伴隨小片段RNA副產物產生。（圖1）

二、連接酶核酶(RzL)及其位于RNA 5 '和3 '端的底物，在體外自主催化RNA環化

接著，研究合成含有相同蛋白質翻譯框，但兩側有RzL和底物序列的poR2載體，進行體外轉錄，并以RzL匹配的相應底物RNA (SUB)加尾，使線性RNA前體可直接自連接形成circRNA。為驗證RzL介導RNA環化的有效性，研究添加polyA聚合酶，以便更好地可視化和評估高效的RNA環狀化。

結果表明，沒有添加RzL的RNA具有poly A，而添加RzL和SUB的大部分RNA不受影響。另一方面，研究利用RNase R處理，檢測circRNA環化效率約為75-100%；PIE介導的環化效率約為50%以上，在熱量和GTP增強的情況下達到75%以上。（圖1）

圖1 傳統內含子-外顯子(PIE)方法以及連接酶核酶(RzL)催化circRNA生成策略的建立。

三、RNA修飾影響RzL-SUB形成circRNA

研究表明低至1%的m6A或m5C修飾輕微影響circRNA的形成，用m6A替換所有的A完全阻斷circRNA的形成，用m5C替換所有的C只輕微阻礙circRNA的形成。然而，m5C修飾的circRNA仍然無法表達蛋白質，這可能是因為m5C阻礙了翻譯所需的IRES結構，或者是因為m5C介導的翻譯抑制。

此外，RzL催化核心的兩個核苷酸T和G替換為G和C的突變也幾乎抑制了RzL的RNA連接活性。平末端PCR產物作為IVT模板時，T7 RNA聚合酶在3 '末端添加了一個外部的非模板核苷酸，會干擾RNA的環化。（圖2）

圖2 RNA修飾影響RzL催化circRNA形成。

四、具有兩個IRES的circRNA會阻礙彼此的蛋白表達

研究發現在一個circRNA表達Fluc和GFP融合蛋白，或利用2a介導的核糖體跳躍分割FLuc和GFP序列，或在一個circRNA中用兩個相同的IRES分別指導FLuc和GFP的翻譯，表達的熒光及FLuc活性都不如兩個circRNA分別表達的強，可能是外部IRES中的cis，而非trans阻礙了circRNA的翻譯（圖3）

圖3 外部IRES中的cis，而非trans阻礙了circRNA的翻譯。

五、高翻譯效率可能賦予circRNA抗病毒潛能

研究團隊考慮到黃病毒（JEV）RNA可以復制并隱藏在ER相關膜結構中，通過circRNA表達修飾的Cas13以靶向ER (erCas13)。單獨遞送erCas13 circRNA顯示出基礎抗病毒活性，并利用GFP指示病毒的感染情況，未遞送RNA組的GFP(+)率達到~81%時，erCas13 circRNA將病毒感染抑制至GFP(+)率低約63%。添加sgRNA, erCas13 circRNA可以進一步將病毒感染降低至~45% GFP(+)。轉染erCas13線性mRNA或circRNA后，都持續表現出一定水平的抗病毒活性。然而，與mRNA相比，erCas13 circRNA翻譯更多的erCas13，以幫助sgRNA獲得更好的抗病毒活性。（圖4）

圖4 IRES驅動表達erCas13的circRNA可能對重組RNA病毒JEV-GFP具有抗病毒作用。

總結

研究通過系統篩選的順式作用連接酶核酶(RzL)對單鏈RNA進行共價環化，研究最小化了RzL作用所需的RNA序列。RzL策略在體外轉錄(IVT)過程中招募了一個攜帶5'-三磷酸基團 (ppp)的RzL，并直接和自主地加入到3 '端相應的底物序列中。與GTP促進circRNA形成的剪接方法不同，RzL策略高度依賴于酶-底物RNA配對產生circRNA而沒有副產物RNA。此外，團隊研究了表達兩種蛋白circRNA的翻譯特性，并驗證了編碼Cas13 circRNA的抗RNA病毒潛能，這為circRNA在外源蛋白功能和應用方面的研究提供了重要信息。

原文鏈接

https://www.nature.com/articles/s41467-024-51044-y?